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快速培養在結核病細菌學診斷中的應用

王蘇民 付育紅 李云絮 趙麗平 畢志強 衛生部結核病控制中心

   近年來全球結核病疫情的回升已經引起了人們的強烈注意。而人口的增加、AIDS合并結核病、耐藥結核病和移民是引起結核病疫情回升的四個重要原因。嚴重地危害了廣大人民的健康水平。結核病當今全球范圍最具有臨床意義的感染性疾病之一,是單因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病,是一個嚴重的公共衛生問題。WHO1993年宣布"全球結核病緊急狀態",號召全世界動員起來"主動制止結核病"。

一、我國結核病疫情的嚴重性
   我國屬于全球結核病高負擔國家之一。結核病的患病人數在世界各國中居于第二位。結核病是危害人民健康的重要傳染病之一。我國的結核病疫情呈三高一低,即患病率高、死亡率高、耐藥率高、年遞降率低。估計全國有肺結核病患者600余萬人,75%的病人年齡在15-54歲之間結核病成為當前農村中因病致貧,因病返貧的主要傳染病。

二、結核病細菌學檢查現狀
   結核病人的細菌學檢查,是發現傳染源的主要途徑和手段,是確定結核病診斷和化療方案的重要依據,也是考核療效,評價治療效果的可靠標準,是國家結核病控制規劃(NTP)的重要組成部分。在結核病防治工作中起著不可缺少的重要作用。但常用的細菌學檢查方法尚存在著靈敏度低,操作復雜,須時間較長和影響因素較多等問題。因此,發展特異,敏感,早期,快速,簡便和預測預后的結核病細菌學檢查方法是大家共同期盼的。

三、常用的細菌學檢查方法
1、痰涂片鏡檢法:特點:快速,當天出結果,但不分死菌活菌,敏感性低,需5000-10000條菌/ml,特異性差,各種抗酸桿菌均可著色。
2、痰結核菌常規培養法;特點:時間長,2-8周,但可分死菌活菌,敏感性低,涂片陽性標本只有約80%培養陽性特異性差,各種分支桿菌均可生長,須結合藥物敏感性實驗和分支桿菌菌種鑒定須時更長。
3、藥物敏感性實驗:用于鑒定結核分支桿菌對抗結核藥物的敏感性水平。
4、分支桿菌菌種鑒定:用于鑒定分支桿菌菌種。

四、痰結核菌常快速養系統:
   由于分枝桿菌的遺傳特性決定的生長周期長、致使常規細菌學檢查方法檢出率低、不易標準化等原因,使細菌學診斷發展緩慢,無法充分滿足臨床診斷的需要。20世紀70年代發展了的一種新的結核病細菌學檢查方法---痰結核菌常快速養,這一方法具有操作簡單,自動化強,靈敏,快速等優點。促進了結核病細菌學診斷學的發展。最早使用的儀器是美國BD公司研制生產的全自動分枝桿菌檢測系統BACTEC?460TB。這一系統多年來在結核病的細菌學診斷中起到了重要作用,但是由于采用了放射性同位素, 存在放射性污染問題。BD公司于1998年又研制推出了大容量、安全、快速、全自動分枝桿菌培養、檢測、藥敏系統-BACTEC? MGIT? 960系統。采用連續熒光探測法,避免了放射性元素對環境的污染。

1、工作原理:
1)BACTEC?460TB系統檢測原理:是測定分枝桿菌的代謝產物,在Middlebrook? 7H12培養瓶中加入含有放射性14C棕櫚酸底物,當檢測標本經處理接種于含雜菌抑制劑NAP的培養瓶內,如有分枝桿菌存在,分枝桿菌代謝時將酶解培養瓶中標記14C棕櫚酸基底物,使其脫羧產生帶有放射性的14CO2,BACTEC?460TB將培養瓶中14CO2送入電離室,并自動顯示測定結果,以生長指數GI(GROWTH INDEX)表示,如生長指數升高達到一定程度報告陽性結果。

2)BACTEC? MGIT? 960系統工作原理:使用BBL? MGIT?分枝桿菌快速培養管。在MGIT? Middlebrook?7H9培養基底部硅酮樹脂內埋置對氧分子濃度極為敏感的熒光指示劑,若培養管內接種的標本中有分枝桿菌生長,培養管內的氧氣將被消耗,管底的熒光指示劑將在內置紫外激發光的照射下發出熒光,熒光強度變化直接反映培養管內分枝桿菌生長狀態。BACTEC MGIT 960熒光強度記憶探測器將每隔60分鐘連續自動測定培養管內熒光強度的變化,經過計算機處理系統分析從而判斷管內分枝桿菌的生長情況。

2、BACTEC? MGIT? 960系統操作步驟:
1)將待檢樣本用等量N-乙酰-半胱氨酸-4%NAOH混合液去污染消化處理,離心待用。
2)在MGIT管標簽上直接標記
3)旋開MGIT管蓋,在無菌條件下用滴管加入0.8mlOADC與PANTA混合液
4)加入0.5ml處理好的標本(注意:標本量超過0.5ml會增加污染機會)
5)旋緊管蓋,適當混勻
6)拉開BACTEC MGIT 960的抽屜,按下放入標本鍵,此時條形碼掃描器會自動開啟,將標本管靠近條形碼掃描器,輕輕轉動,將標本管放入閃綠色LED燈的位置,關上抽屜,儀器自動檢測。

3、衛生部結核病控制中心于2000年購進了BACTEC? MGIT? 960系統并與原有的BACTEC?460TB系統進行了初步的比較。結果如下:
1)為了對BACTEC?460TB與BACTEC? MGIT? 960及改良羅氏培養系統進行比較,我們收集了105份臨床標本,其中結核病例82份,其他肺部疾病23例。在82份結核病病例中,960陽性25份,460陽性17份。其它肺部疾病23例均為陰性。結果見表1:
           表1:BACTEC? MGIT? 960與BACTEC?460TB
           樣本數   總陽性率   涂陽培陽(%)   涂陽培陰(%)  涂陰培陽(%)
    BACTEC960   82    30.5%    19 (86.4)     3 (13.6)    6 (10.0)
    BACTEC460   82    20.7%    13 (59.1)     7 (31.8)    4 (6.7)
   從上表中可以看出,BACTEC? MGIT?960的培養陽性率(30.5%)高于BACTEC?460TB(20.7%),陽性率有所增加。

2)我們對BACTEC? MGIT? 960與BACTEC?460TB的陽性報告時間進行了比較,結果見表2。
         表2:BACTEC? MGIT? 960與BACTEC?460TB的陽性報告時間的比較
   陽性報告時間(天) 3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  15  16
   BACTEC 960系統   16   4     5
   BACTEC 460系統   1  1    3  2  2  4     1  2          1
   從表2的結果可以看出BACTEC? MGIT? 960系統較BACTEC?460TB系統的陽性報告時間有明顯的減少。BACTEC? MGIT? 960系統報出陽性結果的比例3天為64%,5天為80%,7天為100%;BACTEC?460TB系統報出陽性結果的比例3天為4%,7天為28%,11天為88%。

3)我們也集中收集了26份臨床結核病例,同時用BACTEC960,BACTEC 460與羅氏培養作比較,BACTEC960陽性12例,BACTEC 460陽性5例,羅氏培養陽性12例,比較表3:
            表3:BACTEC? MGIT? 960與羅氏培養的比較
        樣本數 總陽性率  涂陽培陽(%)  涂陽培陰(%) 涂陰培陽(%)
   BACTEC960  26  30.8%    8(100.0)    1 (12.5)    3(16.6)
   BACTEC460  26  19.2%    5(100.0)
   羅氏培養   26  30.8%    8(100.0)    1 (12.5)    3(16.6)
   從表3可以看出,BACTEC960,BACTEC460與羅氏培養的結果大致相似。但由于研究的例數太少,尚無法得出更多的結論。

五、結論:
  結核病細菌學快速檢測方法已經有了20多年的歷史,在世界上多個國家得到廣泛的應用,取得了良好的效果。儀器檢測標本的種類廣泛可包括:痰、胸腹水、體液、腦脊液、組織塊等非血液標本。與常規培養相比,自動化強,減少了煩瑣的人工勞動;陽性報告時間較常規培養明顯縮短;且可以動態檢測。在結核病控制工作中發揮了重要作用。特別是BACTEC MGIT 960問世以后克服了BACTEC 460 TB的不足之處使這一技術進一步完善。BACTEC MGIT 960與BACTEC 460 TB具有以下的優點:
1. 無放射性污染,由此可省去相關的步驟和廢棄物的處理,節省了實驗室空間,保護了工作人員免受放射性元素污染。
2. 系統提供由微電腦控制的培養箱,提供分枝桿菌生長需要的最佳環境。
3. 系統內置計算機,采用圖形界面,簡單易懂,可自動存儲數據,支持多機相連。
4. 內置條形碼掃描器、軟盤驅動器、各種指示燈,工作人員的各步操作一目了然,方便快捷。
5. 采用抽屜式培養箱放置標本,每個抽屜內有320個瓶位,一共有960個瓶位,每年可處理8000份標本,適用于各級實驗室的檢測需求。
6. 系統24小時連續檢測,每小時自動測定一次培養管的熒光強度變化,利于快速早期發現分枝桿菌生長情況,使陽性標本檢出時間縮短至3-6天。并且系統內置實驗標準管,每小時自動進行一次質控,自動化程度高。

  為了適合樣本量小的用戶的需求,BD公司還推出了BBL? MGIT?手工熒光判讀器,工作原理、實驗步驟、使用的耗材與BACTEC? MGIT? 960相同的,它可以直接判斷培養結果,內含定標管,操作簡單快捷。由于其設計精巧,便于攜帶,使其更適合異地考察,進行流行病學調查等工作的需要。



 
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